(*UV 280 nm: 0.029 -7.500 mg/mL, UV 300 nm: 0.117-40.000 mg/mL)

圖1. ProAqa Excel 填料掃描電鏡圖

均一的Sepax填料顆粒(20 µm) D90/D10<1.3

空白對照

　　要使用高純度的緩沖液，緩沖液使用前需要排氣和過濾（0.22 μm）。進樣前，請務(wù)必做空白對照，并仔細(xì)檢查峰積分結(jié)果中是否存在噪音或基線繪制不正確。為了降低結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液轉(zhuǎn)變時引起的基線波動，建議使用：

　　（a）50 mM磷酸鹽（pH 7.0），0.15 M NaCl作為起始/沖洗溶液。

　　（b）100 mM磷酸鈉，0.15 M NaCl（pH 2.5）或100 mM甘氨酸，0.15 M NaCl（pH 2.5）作為洗脫緩沖液。

　　這些是對信號噪音最小化最有效的洗滌/洗脫液。鹽酸（HCl）能使抗體變性，所以洗脫產(chǎn)品如果需要生物活性的話，不建議添加HCl。

起始/沖洗溶液

　　（a）大多數(shù)情況下，可以使用簡單的緩沖液，例如10-100 mM的磷酸鹽或Tris。

　　（b）結(jié)合/洗脫緩沖液的pH范圍為6.0-7.5，但是請注意，在較高的pH范圍下結(jié)合力最強。

　　（c）添加一些鹽（0.1-0.2 M NaCl或KCl）抑制蛋白間相互作用的非特異性吸附。

洗脫條件

　　對于分析應(yīng)用，使用25-100 mM磷酸鹽（pH 2.0-3.5），含或不含高達150 mM的NaCl。可以使用的其他洗脫緩沖液成分包括磷酸鈉、鹽酸、甘氨酸、檸檬酸鹽、醋酸鹽以及其他含低pH成分的緩沖液。

　　由于抗體的結(jié)合/洗脫行為因種類和亞類而異，因此應(yīng)憑經(jīng)驗確定最佳洗脫條件。

樣品準(zhǔn)備和上樣

　　為了保證高效結(jié)合和避免柱子濾片堵塞，樣品一般按以下方式準(zhǔn)備：

　　（a）溶解或交換樣品到起始/洗滌緩沖液，這對于大份樣品（大于25%柱體積）尤其重要。

　　（b）進樣前離心或用0.22 μm濾膜過濾樣品。

　　（c）熱處理血清樣品（56℃加熱30 min）去除殘留的纖維蛋白原，它們會在多次運行中阻塞色譜柱。

　　（d）盡可能對樣品脫脂，因為脂質(zhì)會引起不可逆的結(jié)垢。

　　為保證高效結(jié)合及避免填料和色譜柱污染，需要確認(rèn)上樣量：

　　（a） 圖2和圖3顯示了ProAqa Excel色譜柱的動態(tài)測試范圍。

　　（b） 其他抗體的結(jié)合能力取決于抗體來源和亞類。

　　（c） 需要優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件并用樣品確認(rèn)，以確保達到最夠的結(jié)合平衡和完全洗脫。

　　（d） 在分析應(yīng)用中，最小和最大載量應(yīng)該通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性確定（如圖2所示，對于樣品濃度在0.029-7.500 mg/mL的常用定量分析，可以將檢測波長設(shè)置為280 nm。如圖3所示，如果樣品濃度較高（高達40 mg/mL），波長可設(shè)置為300 nm。在該分析應(yīng)用中，建議使用雙波長檢測（280 nm和300 nm）。